茅苍术及其麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎作用的比较研究(3)

　　2.7 免疫组织化学法检测胃组织中TNF-α和IL-8的表达胃组织石蜡切片（5 μm），常规脱蜡至水。将玻片放入装有0.01 mol·L^-1柠檬酸钠溶液的容器中，置微波炉中加热至95 ℃以上，保持10 min，以修复抗原。滴加3%H₂O₂，室温孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶活性。滴加10%正常山羊血清，室温孵育20 min。滴加兔抗大鼠TNF-α和IL-8（1∶100）一抗工作液，4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加适量生物素化二抗工作液，37 ℃孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。加入3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色剂显色10 min。自来水充分冲洗。用中性树胶封片。显微镜下观察染色标本，棕黄色或棕褐色为阳性表达。每个标本随机选取10个视野，用奥林巴斯数据成像系统和 JD801形态学图像分析系统测定平均吸光度，进行半定量分析。
　　2.8 统计学方法采用SPSS 10.0软件，多组间比较应用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，方差齐采用LSD方法（最小显著差法），方差不齐采用Tamhane′s T₂方法（近似方差分析），并进一步行两两比较。结果均以±s表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 ELISA法检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE₂的含量与假手术组比较，模型组4种炎症因子含量显著升高，与模型组比较，各给药组均呈现含量下降的趋势；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，除个别指标炒低组与生低组无显著性差异外，其他各指标组间均呈现炒低组与生低组、炒中组与生中组、炒高组与生高组之间存在显著性差异（图1，2）。在降低IL-6，IL-8，TNF-α和PGE₂的含量方面，茅苍术麸炒品的作用优于生品。
　　3.2 胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的相对表达量与假手术组比较，模型组大鼠胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量显著升高；与模型组比较，各给药组均呈现胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量下降的趋势，除TNF-α生低组及炒低组外，差异有显著性；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，除TNF-α炒低组与生低组无显著性差异外，组间均呈现炒低组与生低组、炒中组与生中组、炒高组与生高组之间存在显著性差异（图3）。在降低胃组织中IL-8，TNF-α mRNA的相对表达量方面，茅苍术麸炒品的作用优于生品。
　　3.3 免疫组化法检测胃组织中IL-8和TNF-α蛋白表达与假手术组比较，模型组大鼠胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量显著升高；与模型组比较，各给药组均呈现胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量下降的趋势，除生低组外，差异有显著性；茅苍术生品及麸炒品3个剂量组各指标均呈现一定的量效关系；经进一步组间两两比较，呈现炒低组低于生低组、炒中组低于生中组、炒高组低于生高组的趋势；与茅苍术生品比较，茅苍术麸炒品具有更好的降低胃组织中IL-8，TNF-α蛋白表达量的作用（图4）。
　　4 讨论
　　中药炮制是中医药应用的重要组成部分，是几千年中华中医药文化的瑰宝，中药炮制技术是我国所特有的，“生熟异治”更是中药在临床应用的鲜明特色^[12]。茅苍术为临床常用中药，传统认为其生品燥性较强，多炮制后入药，麸炒茅苍术目前应用最为广泛，也是药典收载的唯一的炮制品种。本实验采用乙酸诱导大鼠胃溃疡模型，比较茅苍术麸炒前后对胃溃疡大鼠的抗炎作用。乙酸法是目前使用较多的一种慢性胃溃疡造模方法，一般认为乙酸法造成的溃疡模型病理形态特点与修复过程与人类消化性溃疡相似^[7]，广泛用于胃溃疡的病理生理学研究、抗溃疡药物的疗效研究以及溃疡愈合的机制研究等。本实验参考Okabe方法并进行了适当的改良，在圆形挟闭区内同时注射矿物油和乙酸，矿物油比重小于乙酸，可以保护一侧胃壁，因此形成的是单个圆形深浅一致的溃疡面。
　　PGE₂是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸，是一种重要的细胞生长和调节因子。然而，PGE₂过量则会成为一种较强烈的炎症因子，参与炎症反应过程，增加血管的通透性^[13]。IL-8是一种很强的中性粒细胞趋化因子和活化因子，对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用^[14-15]。IL-8通过促进中性粒细胞浸润及酶释放、释放氧自由基而诱发一系列病理生理变化，引起局部的炎症反应，最终导致黏膜损伤，甚至组织器官损伤^[16-17]。IL-6属前炎性细胞因子，在炎症反应的诱导和延续中起重要作用^[18]。TNF-α是一种重要的促炎因子，其本身具有细胞毒作用，可导致炎症、细胞坏死等，从而促进胃肠细胞的组织损害。同时，其通过诱导单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞产生并释放IL-8 等炎症因子，TNF-α亦可提高单核细胞趋化因子的分泌，促进免疫炎症反应的进展^[19-21]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组4种炎症因子均显著升高，茅苍术生品组和麸炒品组4种炎症因子均有不同程度降低。与生品组比较，茅苍术麸炒品相同剂量组血清和胃组织中PGE₂，IL- 6，IL-8和TNF-α的含量降低，其中炒中组与生中组、炒高组与生高组差异均具有显著性，血清中TNF-α的含量炒低组与生低组有显著性差异。茅苍术麸炒品胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的相对表达量低于相同剂量的生品组，其中炒中组与生中组、炒高组与生高组差异均具有显著性，IL-8 mRNA的相对表达量炒低组与生低组有显著性差异。
　　综上所述，茅苍术麸炒后对乙酸致胃溃疡大鼠的抗炎作用明显增强，同时初步表明了茅苍术抗胃溃疡的作用机制部分是通过下调炎症因子而发挥抗炎作用。化学成分是中药发挥药效的物质基础，麸炒茅苍术抗炎作用增强，是否茅苍术经炮制后某些成分含量发生了变化，或是新增加了某些成分，亦或是促进了血液吸收，经口服给药后增加了血药浓度，这些都有待于进一步探讨，本课题组正在进行相关的深入研究。

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